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一、elisa的原理

elisa的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。在测定时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度。

二、elisa的类型

elisa可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂:(1)固相的抗菌素原或抗体,即"免疫吸附剂"(immunosorbent);(2)酶标记的抗原或抗体,称为"结合物"(conjugate);(3)酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的elisa检测方法主要有以下几种类型:

夹心法

夹心法常用于检测大分子抗原,一般之操作步骤为:

将具有专一性之抗体固著(coating)于塑胶孔盘上,完成后洗去多余抗体

加入待测检体,检体中若含有待测之抗原,则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结

洗去多余待测检体,加入另一种对抗原专一之一次抗体,与待测抗原进行键结

洗去多余未键结一次抗体,加入带有酵素之二次抗体,与一次抗体键结

洗去多余未键结二次抗体,加入酵素受质使酵素呈色,以肉眼或仪器读取呈色结果

间接法

间接法常用于检测抗体,一般之操作步骤为:

将已知之抗原固著于塑胶孔盘上,完成后洗去多余之抗原。

加入待测检体,检体中若含有待测之一次抗体,则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。

洗去多余待测检体,加入带有酵素之二次抗体,与待测之一次抗体键结。

洗去多余未键结二次抗体,加入酵素受质使酵素呈色,藉仪器(ELISA reader)测定塑胶盘中的吸光值(OD值),以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。

竞争法

竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制,一般用于检测小分子抗原,其操作步骤为:

将具有专一性之抗体固著于塑胶孔盘上,完成后洗去多余抗体

加入待测检体,使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结

加入带有酵素之抗原,此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结,由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限,因此当检体中抗原的量越多,则带有酵素之抗原可键结的固著抗体就越少,亦即,两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结,即所谓竞争法之由来。

洗去检体与带有酵素之抗原,加入酵素受质使酵素呈色,当检体中抗原量越多,代表塑胶孔盘内留下之带有酵素的抗原越少,显色也就越浅。

当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原,或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时,一般会考虑使用竞争法ELISA。

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