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β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase, β-GC)试剂盒说明书

For Research Use only

仅供研究用

货号:QYS-235001

分光光度法 50管/24样

 

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

β-葡萄糖苷酶β-GC活性测定意义:

β-GC(EC 3.2.1.21)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化 β-糖苷键水解,具有多方面生理作用:在纤维素的糖化作用中,β-GC 负责进一步水解纤维素二糖和纤维素寡糖生成葡萄糖;β-GC 水解萜烯类香气前驱体,使糖苷键合态变成游离态。从而产生香味; β-GC 能够水解植物体内野黑樱苷,释放 HCN,从而防止昆虫取食。

β-葡萄糖苷酶β-GC活性测定原理:

β-GC 分解对-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚,后者在 400nm 有最大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算 β-GC 活性。

自备用品:

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制:

提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存。

试剂一:粉剂×2 瓶,-20℃保存;临用前每瓶加入 10mL 蒸馏水,充分溶解备用;用不完的试剂仍-20℃保存。

试剂二:液体 25mL×1 瓶,4℃保存。试剂三:液体 50mL×1 瓶,4℃保存。

粗酶液提取:

1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次); 15000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

β-葡萄糖苷酶β-GC活性测定步骤:

1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 400nm,蒸馏水调零。

2、加样表

试剂名称(μL)

测定管

对照管

试剂一

400


试剂二

500

500

样本

100

100

迅速混匀,放入 37℃准确水浴 30min 后,立即放入 95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失),流水冷却后充分混匀(以保证浓度不变)


试剂一




400











充分混匀,8000g,4℃,离心 5min,取上清液




上清液


500


500



试剂三


1000


1000



充分混匀,室温静置 2min 后, 400nm 处测定吸光值 A,计算 ΔA=A 测定管-A 对照管。每个测定管需设一个对照管。

β-葡萄糖苷酶β-GC活性测定计算:

标准条件下测定的回归方程为 y =0.00543x -0.0027;x 为标准品浓度(nmol/mL),y 为吸光值。

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

β-GC 活力(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T

=61.39×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

需要另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g 组织每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

β-GC 活力(nmol/min /g 鲜重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T

=61.39×(ΔA+0.0027) ÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

β-GC 活力(nmol/min /10cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00543×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总)÷T

=0.123×(ΔA +0.0027)

V 反总:反应体系总体积,1mL;V 样:加入反应体系中样本体积,0.1mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g; 500:细胞或细菌总数,500 万;T:反应时间,30min。

注:系统试剂盒说明书仅供参考、具体请参考试剂盒纸质版说明书。

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