硫氧还蛋白氧化还原酶（thioredoxin reductase, TrxR）试剂盒说明书

For Research Use only

仅供研究用

货号：QYS-231065

分光光度法 50管/48样

注意：正式测定之前选择2-3 个预期差异大的样本做预测定。

硫氧还蛋白氧化还原酶活性测定意义：

硫氧还蛋白氧化还原酶TrxR是一种 NADPH 依赖的包含 FAD 结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，与硫氧还蛋白以及 NADPH 共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR 与 GR 活性类似，催化 GSSG 还原生成 GSH，是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。

硫氧还蛋白氧化还原酶TrxR活性测定原理：

硫氧还蛋白氧化还原酶TrxR催化 NADPH 还原 DTNB 生成 TNB 和 NADP+，TNB 在 412 nm 有特征吸收峰，通过测定 412nm 波长处 TNB 的增加速率，即可计算 TrxR 活性。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、可调节移液器、1mL 玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入 5 mL 蒸馏水溶解。试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 5 mL 蒸馏水溶解。

粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体：直接测定。

硫氧还蛋白氧化还原酶TrxR活性 测定操作：

1. 分光光度计预热 30 min，调节波长到 412nm，用蒸馏水调零。

2. 试剂一在 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）预热 30min。

3. 空白管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 100μL 试剂二，100μL 试剂三，800μL 试剂一，迅速混匀后于 412 nm 测定 10 s 和 310 s 吸光度，记为 A1 和 A2。△A 空白管=A2-A1。

4. 测定管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 100μL 试剂二，100μL 试剂三，700μL 试剂一，100μL上清液，迅速混匀后于 412 nm 测定 10 s 和 310 s 吸光度，记为 A3 和 A4。△A 测定管=A4-A3。

注意：空白管只需测定一次。 

硫氧还蛋白氧化还原酶TrxR活性计算公式：

(1).  按蛋白浓度计算

 活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活单位。

 TrxR（nmol/min /mg prot）=（△A 测定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T = 147×（△A 测定管-△A 空白管）÷Cpr

(2).  按样本质量计算

活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每克样本每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活单位。

 TrxR（nmol/min /g 鲜重）=（△A 测定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T = 147×（△A 测定管-△A 空白管）÷W

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每 10⁴ 个细胞每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活单位。

 TrxR（nmol/min/10⁴ cell）=（△A 测定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T= 147×（△A 测定管-△A 空白管）÷ 细胞数量

（4）按液体体积计算

 活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫升液体每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活单位。

 TrxR（nmol/min /mL）=（△A 测定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反总÷V 样÷T = 147×（△A 测定管-△A 空白管）

ε：TNB 在 412nm 处的微摩尔消光系数，0.0136 L/μ mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积（L），1000μL=0.001 L；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），蛋白质含量需要另外测定建议选用本公司生产的 BCA 蛋白质浓度测定试剂盒（货号：QYS-237014）； V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），100μL=0.1 mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；W，样本质量，g；T：反应时间（min），5 min。

硫氧还蛋白氧化还原酶TrxR活性试剂盒注意事项:

1. 测定前须先取 1～2 个样做预实验，使得吸光值在 5min 内程线性变化。哺乳动物组织及血液制品 TrxR 活力测定时，一般须用蒸馏水稀释 5 倍左右；测定过程操作须迅速。

2. 试剂二和试剂三配制好后 3 天内使用完。

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