超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)试剂盒说明书
For Research Use only
仅供研究用
货号:QYS-23027
微量法 100 管/96 样
相关系列:进口超氧化物歧化酶( SOD)试剂盒、小鼠超氧化物歧化酶( SOD)ELISA试剂盒
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义:
超氧化物歧化酶SOD(EC 1.15.1.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化超氧化物阴离子发生岐化作用,生成 H2O2 和 O2。SOD 不仅是超氧化物阴离子清除酶,也是 H2O2 主要生成酶,在生物抗氧化系统中具有重要作用。
超氧化物歧化酶测定原理:
通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O2-.),O2-.可还原氮蓝四唑生成蓝色甲臜,后者在 560nm 处有吸收;SOD 可清除 O2-.,从而抑制了甲臜的形成;反应液蓝色越深,说明 SOD 活性愈低,反之活性越高。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、离心机、移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水
超氧化物歧化酶试剂的组成和配制:
提取液:100mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一: 5mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×3 瓶,4℃保存,用时每支加 4mL 蒸馏水,充分溶解,现配现用;
试剂三:液体 200μL×1 支,4℃保存;
试剂四:液体 4mL×1 瓶,4℃保存。
粗酶液提取:
1、 细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次); 8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待 测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
超氧化物歧化酶( SOD)试剂盒测定步骤:
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 560nm,蒸馏水调零。
2、 将试剂三用蒸馏水稀释两倍,用多少配多少。
3、 测定前将试剂一、二和四 37℃(哺乳动物)25℃(其他物种)水浴 5min 以上。
4、 样本测定(在 EP 管或 96 孔板中依次加入下列试剂)
| 试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
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| 试剂一 | 45 | 45 |
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| 试剂二 | 100 | 100 |
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| 试剂三 | 2 | 2 |
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| 样本 | 18 |
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| 试剂四 | 35 | 35 |
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| 蒸馏水 |
| 18 |
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充分混匀,室温静置 30min 后,560nm 处测定各管吸光值 A。
超氧化物歧化酶( SOD)试剂盒注意事项:
1、试剂三为酶,不可冷冻,使用时在冰上放置。
2、对照管只需要做一管。
3、若对照管吸光值大于 1,建议将试剂三用蒸馏水稀释 7 倍后使用(10μL 试剂三原液+60μL蒸馏水)。
超氧化物歧化酶( SOD)试剂盒SOD 活性计算:
1、抑制百分率的计算
抑制百分率=(A 对照管-A 测定管) ÷A 对照管× 100%
尽量使样本的抑制百分率在 10-90% 范围内。如果计算出来的抑制百分率小于 10% 或大于90% ,则通常需要调整加样量后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高,则需将样本用提取液适当稀释;如果测定出来的抑制百分率偏低,则需重新准备浓度比较高的待测样本。
2、SOD 酶活性单位:在上述黄嘌呤氧化酶藕联反应体系中抑制百分率为 50%时,反应体系中的 SOD 酶活力定义为一个酶活力单位(U/mL)。
3、SOD 酶活性计算:
(1)血清(浆)SOD 活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反总]÷V 样×样本稀释倍数=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率)×样本稀释倍数
(2)组织、细菌或培养细胞 SOD 活力计算:
a.按样本蛋白浓度计算
SOD 活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反总]÷(V 样×Cpr)×样本稀释倍数=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷Cpr×样本稀释倍数
需要另外测定,建议使用齐一生物公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
b.按样本鲜重计算
SOD 活性(U/g 鲜重)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反总]÷(W ×V 样÷V 样总)×样本稀释倍数=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷W×样本稀释倍数
c.按细菌或细胞个数计算
SOD 活力(U/104 cell)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率) ×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总)×样本稀释倍数=0.022×抑制百分率÷(1-抑制百分率)×样本稀释倍数
V 反总:反应体系总体积,0.2mL;V 样:加入反应体系中样本体积,0.018mL;V 样总: 加入提取液体积,1 mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL ;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。
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