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过氧化物酶(PeroxidasePOD)试剂盒说明书

For Research Use only

仅供研究用

货号:QYS-23032

分光光度法:50 管/48样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测

过氧化物酶(POD)活性测定意义:

过氧化物酶POD(EC 1.11.1.7)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物,具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。

过氧化物酶(POD)活性测定原理:

过氧化物酶POD 催化 H2O2 氧化特定底物,在 470nm 有特征光吸收。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水

试剂的组成:

提取液:液体 60mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 60mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:液体×2 瓶,4℃保存,用时每瓶加入 5mL 试剂一充分溶解,用不完的试剂 4℃保存

试剂三:液体 10 mL×1 瓶,4℃保存。

粗酶液提取:

  1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次); 8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测

2、血清(浆)样品:直接检测。

过氧化物酶(POD)活性测定步骤和加样表:

1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 470nm,蒸馏水调零。

2、 测定前将试剂一、二和三在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)放置 10min 以上。

3、 样本测定表

试剂名称(µL)

测定管

样本

15

蒸馏水

270

试剂一

520

试剂二

130

试剂三

135



在 1mL 玻璃比色皿中按顺序加入上述试剂,立即混匀并计时,记录 470nm 下 30s 时的吸光值 A1 和 1min30s 后的吸光值 A2。计算 ΔA=A2-A1。

过氧化物酶检测注意:

1、若一次性测定样本较多,可将试剂一、二、三和蒸馏水按比例配成混合液,在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)放置 10min 以上,测定时加入 15µL 样本和 1055µL 混合液测定。

2、如果 ΔA 小于 0.005,可将反应时间延长到 5min。如果 ΔA 大于 0.5,可将样本用提取液稀释后测定,计算公式中乘以相应稀释倍数。

过氧化物酶(POD)活性计算:

1、血清(浆)POD 活性

单位定义:每 mL 血清(浆)在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 为一个酶活力单位。计算公式:

POD(U/mL)=ΔA×V 反总÷V 样÷0.01÷T =7133×ΔA

2、组织、细菌或细胞 POD 活性

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位定义:每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 为一个酶活力单位。

POD(U/mg prot)=ΔA×V 反总÷(V 样×Cpr)÷0.01÷T =7133×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度建议选用本公司的 BCA 法蛋白含量测定试剂盒(货号:QYS-237014)。

(2)按样本鲜重计算

单位定义:每 g 组织在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 为一个酶活力单位。

POD(U/g 鲜重)=ΔA×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷0.01÷T =7133×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位定义:每 1 万个细菌或细胞在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 为一个酶活力单位。

POD(U/104 cell)=ΔA×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷0.01÷T =14.27×ΔA

V 反总:反应体系总体积,1.07mL; V 样:加入样本体积,0.015mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。

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