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NADH 氧化酶(NADH oxidaseNOX)试剂盒说明书

For Research Use only

仅供研究用

货号:QYS-231022

分光光度法:50 管/48样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测

NADH 氧化酶活性分析测定意义:

NOX(EC 1.6.99.3)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,可在氧气存在下,直接将 NADH 氧化为 NAD。该酶不仅参与 NAD 的再生,而且与免疫反应密切相关

NADH 氧化酶活性分析测定原理:

NADH 氧化酶能够将 NADH 氧化为 NAD,NADH 的氧化与 2,6 二氯酚靛蓝(DCPIP)的还原相偶联,蓝色的 DCPIP 被还原为无色的 DCPIP,在 600nm 下测定蓝色 DCPIP 的还原速率计算出 NADH 氧化酶活性的大小。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水

NADH 氧化酶活性分析试剂的组成和配制:

试剂一:液体 50mL×1 瓶,-20℃保存。

试剂二:液体 10mL×1 瓶,-20℃保存。

试剂三:液体 1mL×1 瓶,-20℃保存。

试剂四:液体 50mL×1 瓶,4℃保存。

试剂五:液体 6 mL×1 瓶,4℃保存。

试剂六:粉剂×2 瓶,-20℃保存;临用前每瓶加入 5mL 蒸馏水;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

NADH 氧化酶活性分析样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

① 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

②  将匀浆 600g,4℃离心 5min。

③  弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。

④  上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的 NOX(此步可选做)。

⑤  步骤④中的沉淀即为线粒体,加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10 秒,重复 30 次),用于 NOX 活性测定。

血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:

1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 600nm,蒸馏水调零。

2、 样本测定

(1)试剂四、试剂五和试剂六于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)孵育 5min。

(2)在 1mL 石英比色皿中加入 40μL 样本、700μL 试剂四、100μL 试剂五和 160μL 试剂六,混匀,记录 600nm  20s 时吸光值 A1  1min20s 后的吸光值 A2,计算 ΔA=A1-A2

NOX 活力单位的计算

1、血清(浆)NOX 活力的计算:

单位的定义:每 mL 血清(浆)在每 mL 反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。

NOX(U/mL)=ΔA×V 反总÷V 样÷0.01÷T=2500×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 NOX 活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。

NOX(U/mg prot)=ΔA×V 反总÷(V 样×Cpr)÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度,建议选用本公司的 BCA 法蛋白含量测定试剂盒(货号:QYS-237014)。

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g 组织在每 mL 反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。

NOX(U/g 鲜重)=ΔA×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷0.01÷T=505×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞在每 mL 反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。

NOX(U/10cell)=ΔA×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷0.01÷T=1.01×ΔA 

V 反总:反应体系总体积,1mL; V 样:加入样本体积,0.04mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量;500:细胞或细菌总数,500 万。

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