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NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)试剂盒说明书

For Research Use only

仅供研究用

货号:QYS-231018

分光光度法:50 管/48样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测

NADP-苹果酸脱氢酶活性分析测定意义:

MDH (EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,线粒体中 MDH 是 TCA 循环的关键酶之一,催化苹果酸形成草酰乙酸;相反,胞浆中 MDH 催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物, 连接多条重要的代谢途径。因此,MDH 在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色,包括线粒体的能量代谢、 苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性,MDH 分为 NAD-依赖的 MDH 和 NADP-依赖的 MDH, NADP-MDH 主要存在于真核细胞中。

NADP-苹果酸脱氢酶活性分析测定原理:

NADP-苹果酸脱氢酶催化 NADPH 还原草酰乙酸生成苹果酸,导致 340nm 处光吸收下降。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1 mL 石英比色皿和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

试剂一、提取液 60 mL×1 瓶,在 4℃保存;

试剂二、液体 50 mL×1 瓶,在 4℃保存;

试剂三、粉剂×2 支,-20℃保存;临用前加入 300μL 蒸馏水;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂四、粉剂×2 支,-20℃保存;临用前加入 300μL 蒸馏水;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

NADP-苹果酸脱氢酶活性分析样本测定的准备:

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。

NADP-苹果酸脱氢酶活性分析测定步骤:

1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、 将试剂二在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min 以上。

3、操作表:

试剂名称(μL)

测定孔

样本

20

试剂二

760

试剂三

10

试剂四

10



将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中,混匀后立即在 340 nm 波长下记录初始吸光度 A1 和反应 1min后的吸光度 A2,计算 ΔA=A1-A2

注意:若 A1-A2 大于 0.5,需将样本用提取液稀释,使 A1-A2 小于 0.5,可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。

NADP-苹果酸脱氢酶活性单位的计算:

1、血清(浆)NADP-MDH 活力的计算单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟消耗 1 nmol的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-MDH(nmol/min/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样÷T=6430×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 NADP-MDH 活力的计算:(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-MDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-MDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T =6430×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-MDH(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样÷V 样总×500)÷T=12.86×ΔA 

V 反总:反应体系总体积,8×10-4 L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.02 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL要另外测定建议选用本公司的 BCA 法蛋白含量测定试剂盒(货号:QYS-237014);500:细胞或细菌总数,500 万。

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