NAD 激酶(NAD kinase, NADK)试剂盒说明书
For Research Use only
仅供研究用
货号:QYS-231012
分光光度法:50 管/48样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
NAD 激酶(NADK)活性测定意义:
NADK(EC 2.7.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是目前所发现的生物体内惟一能够催化 NAD+磷酸化生成 NADP+的酶,可催化 NAD(H)以 ATP 或无机多聚磷酸[poly(P)]作为磷酰基供体进行磷酸化反应,生成 NADP(H)。因此,NAD 激酶在合成 NADP(H)以及调节 NAD(H)与 NADP(H)的平衡上具有重要作用。
NAD 激酶(NADK)活性测定原理:
NADK 催化 NAD+磷酸化,生成 NADP+;NADP+可被 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原为 NADPH; NADPH 通过 PMS 的递氢作用,还原氧化型噻唑蓝(MTT),通过在 600 nm 下测定 MTT 的还原速度(吸光值的变化)可反映出 NADK 活性的大小。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:液体 50 mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 20 mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:液体 50 mL×1 瓶,4℃保存;
试剂三:粉剂×1 瓶,-20 ℃保存;
试剂四:粉剂×1 瓶,-20℃保存;
试剂五:粉剂×1 瓶, -20℃保存;
NAD 激酶(NADK)样本活性测定的准备:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次); 8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
NAD 激酶(NADK)活性测定步骤:
1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 600nm,蒸馏水调零。
2、将试剂一和试剂二 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 15min 以上。
3、工作液Ⅰ的配制:在试剂三中加入 16mL 试剂一,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;工作液Ⅱ的配制:在试剂四中加入 22mL 试剂二,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;工作液Ⅲ的配制:在试剂五中加入 22mL 试剂二,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
4、加样表
充分混匀,37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 15min,立即煮沸2min(盖紧,防止水分散失)冰浴冷却,10000g,25℃离心 10min,取上清
加完试剂混匀后立即在 600nm 下测定 30 秒的吸光值 A1 和 3 分钟 30 秒时的吸光值 A2,计算△A= A2-A1
NAD 激酶(NADK)活性计算:
标准条件下测定的回归方程为 y = 0.002463x +0.004;x 为 NADP 标准品浓度(nmol/mL),y为吸光值。
(1) 按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol NADP 定义为一个酶活力单位。
NADK(nmol/min/mg prot)=[406×(△A - 0.004)×V1]÷(V1×Cpr)÷T=135.3×(△A - 0.004)÷Cpr
需要要另外测定建议选用本公司的 BCA 法蛋白含量测定试剂盒(货号:QYS-237014)
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g 组织每分钟产生 1 nmol NADP 定义为一个酶活力单位。
NADK(nmol/min/g 鲜重)=[406×(△A - 0.004)×V1]÷(W×V1÷V2)÷T =135.3×(△A - 0.004)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol NADP 定义为一个酶活力单位。
NADK(nmol/min/104 cell)=[406×(△A - 0.004)×V1]÷(500×V1÷V2)÷T =0.271×(△A - 0.004)
V1:加入反应体系中样本体积,0.08mL;V2:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,3min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; W:样本质量,g;;500:细胞或细菌总数,500 万。
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