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脂氧合酶(Lipoxygenase, LOX)活性测定试剂盒说明书

For Research Use only

仅供研究用

货号:QYS-233096

分光光度法 50管/48样

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。 

脂氧合酶(LOX)测定意义:

Lipoxygenase 广泛存在于动植物组织中,催化不饱和脂肪酸氧化反应,导致膜脂过氧化。在生物体的生长发育、成熟衰老及逆境胁迫过程中具有重要作用。

脂氧合酶(LOX)测定原理:

Lipoxygenase 催化亚油酸氧化,氧化产物在 280nm 处有特征吸收峰;测定 280nm 吸光度增加速率,来计算 Lipoxygenase活性。

自备仪器和用品:

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计、1mL 石英比色皿、可调式移液枪和蒸馏水。

脂氧合酶(LOX)检测试剂组成和配制:

试剂一:液体 50mL×1 瓶,4℃保存。

试剂二:液体 45mL×1 瓶,4℃保存。

试剂三:粉剂×1 瓶,4℃保存。

粗酶液提取:

按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。16000g,4℃离心 20min,取上清置冰上待测。

脂氧合酶(LOX)测定步骤:

1. 分光光度计预热 30 min,调节波长到 280nm,蒸馏水调零。 

2. 工作液的配制:将试剂三粉剂转移至试剂二中充分溶解(振荡混匀 1min),在 25℃水浴中预热 30 min 以上。

3. 空白管:依次在石英比色皿中加入 100μL 蒸馏水和 900μL 工作液,迅速混匀后于 280nm比色,记录初始吸光值 A1  1min 后的吸光值 A2 A 空白=A2-A1

4. 测定管:依次在石英比色皿中加入 100μL 样本和 900μL 工作液,迅速混匀后于 280nm 比色,记录初始吸光值 A3  1min 后的吸光值 A4 A 测定=A4-A3

注意:空白管只需测定一次。

脂氧合酶(LOX)活性计算公式:

(1)按照蛋白浓度计算

活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟催化吸光值变化 0.01 个单位为 1 个酶活单位。

LOX (U/mg prot) = ( A 测定- A 空白)×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T×100 = 1000×( A 测定- A 空白)÷Cpr

(2)按照样本质量计算

活性单位定义:25℃中每克组织每分钟催化吸光值变化 0.01 个单位为 1 个酶活单位。

LOX (U/g 鲜重) = ( A 测定- A 空白)×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T×100= 1000×( A 测定- A 空白)÷W

Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL,需另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒(货号:QYS-237014); V 样:加入反应体系中上清液体积,100μL=0.1mL;V 反总:反应总体积,1mL;V 样总:上清液总体积,1mL;W:样本质量,g;T:反应时间,1min。

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