柠檬酸(citric acid, CA)含量测定试剂盒说明书

For Research Use only

仅供研究用

货号：QYS-237014

分光光度法 50管/48样

注意正式测定之前选择 2-3 个预期差 大的样本做预测定

柠檬酸(CA)含量测定意义

CA是生物体内常见的有机酸是重要的食品风味物质。此外CA是羧酸循环一反应的产物

柠檬酸(CA)含量测定原理

酸性条件，柠檬酸还原 Cr6+生成 Cr3+  在 545nm 处有特征吸收峰，通过测定 545nm 吸光值的增加，即可计算出样品中柠檬酸含量。

自备仪器和用品

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL 玻璃比色皿和蒸馏水

柠檬酸(CA)含量测定试剂组成和配制

试剂一 液体×1 瓶 4℃保存  

试剂二 液体×1 瓶 4℃保存  

试剂三 液体×1 支 -20℃保存

试剂四 粉剂×1 瓶 室温保存 临用前配制加入 5mL 试剂一 充分溶解

试剂五 液体×1 瓶 4℃避光保存  

标准品 液体×1 支 250µmol/L 柠檬酸标准液 4℃保存

柠檬酸(CA)含量测定样品处理

1. 液体样品：取 0.1mL 液体 试剂一0.9mL，充分混匀，11000g 4℃离心10min取上清液待测

2. 组织：按照组织质量（g）：提取液体 (mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g组织加入1mL 试剂一）进行冰浴匀浆 11000g 4℃离心 10min  取上清置冰上待测

3. 线粒体：按照组织质量（g）提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆 600g/min 4℃离心 5min，取上清至另一 EP 管中11000g  4℃离心 10min弃上清（此上清液可用于细胞质 CA 含量测定）向沉淀中试剂二200µl以及试剂三2µl，充分悬浮溶解 11000g 4℃离心 10min，取上清液待测

4. 细菌、真菌中：按照细胞数量（104个 ）；试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万 胞 入 1mL 试剂一）冰浴超声波破碎细胞（功率300w 超声 3秒 间隔 7秒 总时间 3min）11000g 4℃离心 10min，取上清置冰上待测

柠檬酸(CA)含量测定操作

a. 分光光度计预热 30 min，调节波长到 545 nm，蒸馏水调零。

b. 试剂一置于 30℃水浴中预热 30min

c. 空白管：取 EP 管，依次加入 100µL 蒸馏水，700µL试剂一，100µL 试剂四，100µL 试剂五 混匀后室温静置 30min，于545nm 测定吸光度 记为 A 空白管

d. 标准管：取 EP 管 依次加入 100µL 标准液，700µL 试剂一，100µL 试剂四，100µL 试剂五，混匀后室温静置 30min，于 545nm 测定吸光度 记为 A 标准管

e. 测定管：取 EP 管，依次加入 100µL上清液， 700µL 试剂一 ，100µL 试剂四，100µL 试剂五，充分混匀后室温静置 30min，于 545nm 测定吸光度，记为 A 测定管。

注意 空白管和标准管只需测定一次

柠檬酸(CA)含量测定计算公式:

1.  按液体样本的体积计算  

柠檬酸含量（nmol/L）= [C 标准液×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)]×样品稀释倍数×V总= 2500×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)

C 标准液：250 µ mol/L=0.25m mol/L；样品稀释倍数(0.1mL样品+0.9mL试剂一）÷0.1mL 样本=10；V 总：1.0 mL。

2.  按组织质量计算  

柠檬酸含量（nmol/g 鲜重）= [C 标准液×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)]×V总÷W= 250×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管) ÷W

C 标准液：250 µ mol/L；V 总：上清液总体，1.0 mL=0.001 L；W：样品质，g。

3.按蛋白含量计算  

柠檬酸含量（nmol/mg prot）= [C 标准液×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)]÷Cpr= 250×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)÷Cpr

C 标准液：250 µ mol/L=0.25µ mol/mL  Cpr：上清液蛋白质含量，mg/mL。

4.按细胞数量计算  

柠檬酸含量（nmol/104 cell）= [C 标准液×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)]×V总÷细胞数量= 250×(A 测定管-A 空白管) ÷(A 标准管-A 空白管) ÷细胞数量

C 标准液：250 µ mol/L；V 总：上清液总体，1.0 mL=0.001 L；

注意事项

1.样品处理等过程均需要在冰上进行

2.试剂四需现配现用，配置好的一周内使用完

3.试剂五为易致癌物质，实验过程中，需佩戴手套，避免试剂五溅到皮肤

4.柠檬酸提取液不能用于蛋白含 测定 如需测定蛋白含 需另取组织使用本公司BCA 试剂盒（货号：QYS-237014）进行测定

返回