还原型抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）含量测定试剂盒说明书

For Research Use only

仅供研究用

货号：QYS-23075

分光光度法 50管/48样

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

还原型抗坏血酸（AsA）含量测定意义:

AsA 又称维生素 c。AsA 是辅酶、自由基清除剂、电子共体/受体和草酸盐与酒石酸盐生物合成的底物等。作为植物细胞中最重要的抗氧化剂，AsA 在保护叶绿体免于氧化损伤起着举足轻重的作用，也是衡量农作物产品品质的重要指标之一。

还原型抗坏血酸（AsA）含量测定原理：

抗坏血酸氧化酶（AAO）催化 AsA 氧化生成 DHA，通过测定 AsA 的氧化速率，即可计算出 AsA 含量。

自备仪器和用品：

研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计、1mL 石英比色皿、可调式移液器和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂三：液体×1 瓶，4℃保存。临用前加入 5mL 试剂二，混匀。

标准品：粉剂×1 瓶（棕色），4℃保存。临用前配制，加入 5.679 mL 蒸馏水充分溶解；吸取 0.1 mL 上述溶液，加入 0.9 mL 蒸馏水，混匀，即 100μmol/L AsA。

样品中还原型抗坏血酸（AsA）提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 20min，取上清置冰上待测。

 2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；8000g，4℃离心 20min，取上清液置冰上混匀待测。

3. 血清等液体：直接测定。

还原型抗坏血酸（AsA）含量测定操作：

1. 分光光度计预热 30 min，调节波长到 265 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。

3. 标准管：依次在比色皿中加入 100μL 标准液、800μL 试剂二和 100μL 试剂三，迅速混匀，在 265nm 测定，记录 30s 和 150s 的吸光值 A1 和 A2，△A 标准管= A1 －A2。

4. 测定管：依次在比色皿中加入 100μL 上清液、800μL 试剂二和 100μL 试剂三，迅速混匀，在 265nm 测定，记录 30 s 和 150s 的吸光值 A3 和 A4，△A 测定管= A3 －A4。

注意：标准管只需测定一次。 

还原型抗坏血酸（AsA）含量计算公式:

(1).  按蛋白浓度计算

AsA (nmol/mg prot) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷（Cpr×V 样） =100×△A 测定管÷△A 标准管÷Cpr

(2).  按样本质量计算

AsA(nmol/g 鲜重) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷(W×V 样÷V 样总) =100×△A 测定管÷△A 标准管÷W

(3).  按细胞数量计算

AsA(nmol/10⁴ cell) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷(细胞数量×V 样÷V 样总)=100×△A 测定管÷△A 标准管÷细胞数量

（4）.  按液体体积计算

AsA (nmol/mL) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷V 样=100×△A 测定管÷△A 标准管 

C 标准液：100μmol/L；V 标准：标准液体积，0.1mL；V 样总：上清液总体积，1.0 mL=0.001 L；V 样：加入反应体系中上清液体积，0.1mL；Cpr ：蛋白含量，mg/mL；W：样品质量，g。 

注意事项：

1. 试剂三和标准品现配现用，配制好的 4℃保存，3 天内使用完。

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