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抗坏血酸过氧化物酶APX)活性测定试剂盒说明书

 For Research Use only

仅供研究用

货号:QYS-231096

微量法 100 管/96 样

注意:正式测定抗坏血酸过氧化物酶之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

抗坏血酸过氧化物酶测定意义:

抗坏血酸过氧化物酶APX 是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一,也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。抗坏血酸过氧化物酶APX 具有多种同功酶,分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体,以及过氧化体和类囊体膜上。APX 催化 H2O2 氧化 AsA,是植 AsA 的主要消耗者。APX 的活性直接影响到 AsA 的含量,APX 与 AsA 具有一定的负相关性。

抗坏血酸过氧化物酶检测试剂测定原理

抗坏血酸过氧化物酶APX  催化 H2O2 氧化 AsA,通过测定 AsA 氧化速率,来计算得 APX 活性。 

自备仪器用品

低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板(UV 板)、移液枪、研钵、冰和蒸馏水。

抗坏血酸过氧化物酶测定试剂组成和配制:

试剂一:液体 120mL×1 瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加 3 mL 蒸馏水充分溶解。

试剂三:液体 3mL×1 支,4℃保存。

粗酶液提取:

按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。13000g,4℃离心 20min,取上清置冰上待测。

抗坏血酸过氧化物酶测定前注意事项

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上,调节波长到 290nm,用蒸馏水调零。

2. 试剂一在 25℃中预热 30min。

3. 依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μL 上清液、140μL 预热的试剂一 20μL 试剂二和 20μL 试剂三,迅速混匀后在 290nm 测定 10s 和 130s 光吸收 A1 和 A2,△A=A1-A2。

抗坏血酸过氧化物酶APX 活性计算:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1) 按样本蛋白浓度计算

活性单位定义:每毫克蛋白每分钟氧化 1μmol AsA 为 1 个酶活单位。

APX(μmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d)×V 反总×106÷(Cpr×V 样)÷T =1.79×△A÷ Cpr

(2)按样本质量计算

活性单位定义:每 g 组织每分钟氧化 1μmol AsA 为 1 个酶活单位。

APX(μmol/min/g 鲜重 ) = △A÷(ε×d)×V 反总×106÷(W×V 样÷V 样总)÷T =1.79×△A ÷W

ε:AsA 在 290nm 处摩尔吸光系数为 2.8×103 L/mol/cm;d:比色皿光径(cm),1 cm;V 反

总:反应体系总体积(L),200μL=2×10-4 L;106:1mol=1×106μmol;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒;W :样品质量;V 样:加入反应体系中上清液体积(mL),20μL=0.02mL;V 样总:提取液体积,1 mL;T:催化反应时间(min)2min。

b.使用 96 孔板测定的计算公式如下

(1) 按样本蛋白浓度计算

活性单位定义:每毫克蛋白每分钟氧化 1μmol AsA 为 1 个酶活单位。

APX(μmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d)×V 反总×106÷(Cpr×V 样)÷T =3.58×△A÷ Cpr

(2)按样本质量计算

活性单位定义:每 g 组织每分钟氧化 1μmol AsA 为 1 个酶活单位。

APX(μmol/min/g 鲜重) = △A÷(ε×d)×V 反总×106÷(W×V 样÷V 样总)÷T =3.58×△A ÷W 

ε:AsA 在 290nm 处摩尔吸光系数为 2.8×103 L/mol/cm;d:96 孔板光径(cm),0.5 cm;V反总:反应体系总体积(L),200μL=2×10-4 L;106:1mol=1×106μmol;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒;W :样品质量;V 样:加入反应体系中上清液体积(mL),20μL=0.02mL;V 样总:提取液体积,1 mL;T:催化反应时间(min),2min。

注意事项:

配制好的试剂二 4℃保存,并且 3 天内使用完。

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