细胞色素C氧化酶/复合体Ⅳ测定试剂盒

For Research Use only

仅供研究用

货号：QYS-23018

微量法 100管/96样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

细胞色素C氧化酶/复合体Ⅳ测定意义：

线粒体复合体Ⅳ又称细胞色素 C 氧化酶，也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责催化还原型细胞色素 C 的氧化，

并最终把电子传递给氧，生成水。

细胞色素C氧化酶/复合体Ⅳ测定原理：

还原型细胞色素 C 在 550nm 有特征光吸收，线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞色素 C 生成氧化型细胞色素 C，因此 550nm 光吸收下降

速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。

细胞色素C氧化酶/复合体Ⅳ测定试剂盒需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

细胞色素C氧化酶/复合体Ⅳ测定试剂盒的组成和配制：

试剂一：液体 100mL×1 瓶，-20℃保存； 

试剂二：液体 20mL×1 瓶，-20℃保存； 

试剂三：液体 1.5mL×1 瓶，-20℃保存； 

试剂四：液体 20mL×1 瓶，4℃保存； 

试剂五：粉剂×1 支，-20℃保存；

试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；

细胞色素C氧化酶/复合体Ⅳ测定样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、 将匀浆 600g，4℃离心 5min。

3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11100g，4℃离心 10min。

4、 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ（此步可选做）。

5、 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴， 功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10 秒，

重复 30 次），用于复合体Ⅳ酶活性测定。

细胞色素C氧化酶/复合体Ⅳ测定步骤：

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 550nm，蒸馏水调零。 

2、 样本测定 

（1）工作液的配制：临用前将试剂五和试剂六依次转移到试剂四中混合溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min；

用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

（2）在微量石英比色皿或96 孔板中加入10μL 样本和200μL 工作液，混匀，立即记录550nm

处初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。

注意点：若 ΔA 大于 0.2，需将样本用试剂二稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数），使 A1-A2 小于 0.2，可提高检测灵敏度。

细胞色素C氧化酶/复合体Ⅳ测定公式：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

（1）按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化降解 1 nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=1099×ΔA÷Cpr

蛋白质含量需另外测定，我司提供三种方法蛋白质浓度试剂盒(QYS-237009)双缩脲法、(QYS-237011)考马斯亮蓝法、(QYS-237013)BCA法。

（2）按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟催化降解 1nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力单位。

复 合 体 Ⅳ 活力 (nmol/min/g  鲜 重 )=[ΔA×V  反 总÷ （ ε×d ） ×10⁹]÷(W×  V  样 ÷V  样总)÷T=222×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化降解 1nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.444×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2.1×10^-4 L；ε：细胞色素 C 摩尔消光系数，1.91×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：

加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL； T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，

g；500：细胞或细菌总数，500 万。

b.使用 96 孔板测定的计算公式如下：

（1）按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化降解 1 nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=2198×ΔA÷Cpr

蛋白质含量需另外测定，我司提供三种方法蛋白质浓度试剂盒(QYS-237009)双缩脲法、(QYS-237011)考马斯亮蓝法、(QYS-237013)BCA法。

（2）按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟催化降解 1nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力单位。

复 合 体 Ⅳ 活力 (nmol/min/g  鲜 重 )=[ΔA×V  反 总÷ （ ε×d ） ×10⁹]÷(W×  V  样 ÷V  样总)÷T=444×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化降解 1nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.888×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2.1×10^-4 L；ε：细胞色素 C 摩尔消光系数，1.91×10⁴ L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：

加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，

g；500：细胞或细菌总数，500 万。

注：电子版说明书仅供参考、具体请参考试剂盒纸质版说明书。

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