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辅酶NADP(H)含量试剂盒说明书

For Research Use only

仅供研究用

货号:QYS-231040

分光光度法:50 管/24样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测

辅酶ⅡNADP(H)含量测定意义

辅酶ⅡNADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,NADP+和 NADPH 含量测定可以计算 NADP(NADPH + NADP+ )含量和 NADPH/NADP+比值,其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一,而且在 PPP 途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。

辅酶ⅡNADP(H)含量测定原理

分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NADP+和 NADPH。NADPH 通过 PMS 的递氢作用,使氧化型噻唑蓝(MTT)还原为甲瓒,570nm 下检测吸光值,从而测定 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原 NADP+为 NADPH,从而检测 NADP+含量。

所需的仪器和用品

可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

酸性提取液:50mL×1 瓶,4℃保存;

碱性提取液:50mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 15 mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1 支,-20 ℃保存,用时加入 4mL 蒸馏水混匀,用不完的试剂 4℃保存一周;

试剂三:粉剂×1 支,-20℃保存,用时加入 4mL 蒸馏水混匀,用不完的试剂 4℃保存一周;

试剂四:粉剂×1 支,4 ℃保存,用时加入 4mL 蒸馏水混匀,用不完的试剂 4℃保存一周;

试剂五:液体 1.8mL×1 支,4 ℃保存;

试剂六:液体 30mL×1 瓶,4 ℃保存;

试剂七:液体 50mL×1 瓶,4 ℃保存。

NADP+和 NADPH 的提取

1 血清(浆)中 NADP+和 NADPH 的提取

NADP+的提取:按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1mL 血清(浆),加入 1mL 酸性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

NADPH 的提取:按照血清(浆)体积(mL):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1mL 血清(浆),加入 1mL 碱性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2 组织中 NADP+和 NADPH 的提取:

NADP+的提取按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1g 组织,加入 1mL 酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

NADPH 的提取:按照组织质量(g):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1g 组织,加入 1mL 碱性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

3 细胞或细菌中 NADP+和 NADPH 的提取:

NADP+的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104 个):酸性提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液),超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),95℃水浴 5min (盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

 NADPH 的提取先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(10个):碱性提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液),超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),95℃水浴 5min (盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

辅酶ⅡNADP(H)含量测定步骤

1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 570nm,蒸馏水调零。

2、 加样表(在 1.5mL 棕色 EP 管中按下表依次加样):

试剂名称(μL)

对照管

测定管

样本

50

50

试剂一

250

250

试剂二

75

75

试剂三

75

75

试剂四

75

75

试剂五

35

35

试剂六

500

混匀,室温避光静置 20min

试剂六


500

充分混匀,静置 5min 后,20000g25℃离心 5min,弃上清,沉淀中加入:

试剂七

1000

1000

混匀,570nm 下比色,读取对照吸光值 A1 和测定管吸光值 A2,计算A=A2-A1

辅酶ⅡNADP(H)含量测定注意事项

1、如果一次性测定样本数较多,可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。

2、对照管和测定管的测定步骤的区别:对照管加完试剂一、二、三、四和五后须马上加试剂六;测定管加完试剂一、二、三、四和五后须反应 20min 后再加试剂六。

3、反应过程中注意避光。

4、由于每一个测定管需要设一个对照管,本试剂盒 50 管保证测 24 个 NADP+或 NADPH。

NADP+和 NADPH 含量的计算

(一)NADP+含量的计算

1、血清(浆)中 NADP+含量计算

NADP+含量(nmol/mL)=[4.57× (△A -0.062)×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 91.4×(△A -0.062)

2、组织、细菌或细胞中 NADP+含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADP(nmol/mg prot)=[ 4.57×(△A -0.062)×V1) ]÷(V1×Cpr)= 4.57×(△A -0.062)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NADP(nmol/g 鲜重)= [ 4.57×(△A -0.062)×V1) ]÷(W×V1÷V2)=9.14×(△A -0.062)÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NADP(nmol/104 cell)=[ 4.57×(△A -0.062)×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0183×(△A -0.062)

(二)NADPH 含量的计算

1、血清(浆)中 NADPH 含量计算

NADPH 含量(nmol/mL)=[7.2× (△A -0.072)×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 144× (△A -0.072)

2、组织、细菌或细胞中 NADPH 含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADPH (nmol/mg prot)= [7.2× (△A -0.072)×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.2× (△A -0.072)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NADPH (nmol/g 鲜重)= [7.2× (△A -0.072)×V1) ]÷(W×V1÷V2)=14.4× (△A -0.072)÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NADPH (nmol/104 cell)= [7.2× (△A -0.072)×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0288× (△A -0.072)

V1:加入反应体系中样本体积,0.05mL;V2:加入提取液体积,2mL;V3:加入血清(浆)体积:0.1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL要另外测定建议选用本公司的 BCA 法蛋白含量测定试剂盒(货号:QYS-237014);W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。

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