CRISPR-Cas系统中的一种环寡腺苷酸信号通路

在原核生物的III型CRISPR-Cas系统中，多种Cas蛋白与CRISPR RNA（crRNA）组装在一起形成Csm（对III-A型CRISPR-Cas系统而言）或者Cmr（对III-B型CRISPR-Cas系统而言）效应复合物，Csm或Cmr复合物通过一种转录依赖的DNA沉默来干扰入侵的核酸。在噬菌体感染细菌之后，它的DNA开始转录，以便建立和维持感染周期。在细菌中，这种crRNA引导的Csm/Cmr复合物作为一种监控复合物扫描入侵者的RNA中的互补性靶序列，即前间隔序列（protospacer）。crRNA引导Csm/Cmr结合到入侵者的RNA上，从而触发Csm3/Cmr4亚基切割这种RNA，并且同时激活Cas10亚基的单链DNA酶活性，从而降解转录泡（transcription bubble）中的单链DNA。Csm或Cmr复合物通过检查crRNA 5’-柄与RNA靶序列的3’端侧边序列之间的互补性来避免自身免疫反应。crRNA 5’-柄与噬菌体的靶RNA存在碱基配对会抑制Cas10的单链DNA酶活性，因而保护宿主DNA不被降解。crRNA 5’-柄与噬菌体的靶RNA不存在互补性会表明转录泡中的单链DNA是非自我DNA模板，从而激活Cas10的单链DNA酶活性，将它降解。
Cas10亚基在III-A型CRISPR-Cas系统中也被称作Csm1，在III-B型CRISPR-Cas系统中也被称作Cmr2。它含有一个N末端HD结构域，两个小的α螺旋结构域和两个Palm结构域。这两个Palm结构域都具有一个铁氧化还原蛋白类似的折叠（ferredoxin-like fold），而且这个折叠区域具有核酸聚合酶和核苷酸环化酶的核心结构域。在体外，Cas10的HD结构域负责降解单链DNA。人们猜测在一个Palm结构域中的保守性GGDD基序会产生环核苷酸（cyclic nucleotide），但是它的作用并未得到证实。来自强烈炽热球菌（Pyroccocusfuriosus）的Cas10（以下称PfCas10）独自时和与Cmr3结合在一起时的晶体结构表明一个ADP、一个3’-AMP或两个ATP可结合到Palm结构域中的GGDD基序和P环基序的氨基酸残基上。这种腺嘌呤结合口袋的保守性提示着Cas10的Palm结构域可能具有酶活性，但是这种活性的性质是未知的。
为了解决这个问题，在一项新的研究中，来自立陶宛维尔纽斯大学的研究人员研究了嗜热链球菌（Sterptococcus thermophilus）III-A型CRISPR-Cas系统中的Cas10（以下称StCas10）是否具有ATP依赖的催化活性。他们通过生化反应实验证实在嗜热链球菌Csm（以下称StCsm）复合物中，Cas10亚基的GGDD基序负责将ATP转化为一种未知的反应产物X，而且这种反应依赖于Mn2+, Co2+或Zn2+，此外也较低程度地依赖于Mg2+或Fe2+。当然最为关键的是，这种反应特别依赖于靶RNA识别和crRNA 5’-柄与靶RNA的3’端侧边序列之间的非互补性。
为了确定反应产物X的身份，这些研究人员利用聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC和质谱技术证实反应产物X是一种环寡腺苷酸（cyclic oligoadenylate, cOA）混合物，其中环三腺苷酸（cA3）是主要的产物。这就表明作为对病毒核酸入侵作出的反应，在StCsm复合物中，Cas10亚基的GGDD活性位点催化cOA合成。鉴于基于核苷酸的小分子化合物，如cAMP、cGAMP、p2Gpp、p3Gpp和NAADP，在多种有机体中作为信号分子发挥作用，他们猜测这些cOA也可能是原核生物的抗病毒防御通路中的信号分子。考虑到这些基于核苷酸的信号分子通常结合到传感蛋白（sensory protein）上，他们也想要鉴定出cOA的传感蛋白。
很多CRISPR-Cas系统与似乎并不直接参与间隔序列获得、CRISPR转录本加工或干扰入侵性核酸的蛋白结合在一起，其中最为常见的是Csm6/Csx1蛋白。嗜热链球菌的III-A型CRISPR-Cas位点编码两个Csm6同源物：StCsm6和StCsm6’，不过它们都不是这个StCsm复合物的一部分。这两个同源物具有保守的Csm6结构：N末端的CARF结构域，接着是α-螺旋区域和C末端的HEPN结构域。分子建模揭示出StCsm6和StCsm6’的CARF结构域核心区最类似于嗜热栖热菌（Thermusthermophilus）Csm6蛋白（TtCsm6）的相应结构域。属于HEPN超家族的结构域经常表现出RNA酶活性。
为了理解Csm6蛋白在嗜热链球菌CRISPR-Cas免疫系统中的作用，这些研究人员发现StCsm6和StCsm6’表现出不依赖于金属离子的单链RNA（ssRNA）降解活性，而且这种降解活性依赖于保守的HEPN活性位点上的氨基酸残基：RXXXXH。显著的是，它们的ssRNA降解活性是较弱的，仅在较高的蛋白浓度（微摩尔范围）下才是明显的。他们猜测StCsm复合物产生的cOA可能作为StCsm6和/或StCsm6’的CART结构域的配体发挥作用。他们首先证实cOA混合物显著地增加StCsm6和StCsm6’的单链RNA酶活性，降低所需的蛋白浓度大约1000倍，而且它们不能够降解双链RNA（dsRNA）和单链DNA（ssDNA），这意味着它们是ssRNA特异性的核酸酶。此外，通过开展一系列实验，他们证实StCsm6和StCsm6’的CARF结构域作为StCsm复合物产生的cOA配体的传感蛋白发挥作用。 
为了确定哪种cOA是StCsm6和StCsm6’的激活物，这些研究人员开展核酸酶测试，结果揭示出在所有测试过的cOA中，仅cA6（环六腺苷酸）激活StCsm6和StCsm6’的RNA酶活性。有趣的是，是cA4（环四腺苷酸）而不是cA6激活TtCsm6的RNA酶活性。在相同的反应条件下，线性的寡腺苷酸并不激活StCsm6或TtCsm6。这似乎表明cOA是多种III型CRISPR-Cas系统中通用的信号分子。这一发现提示着Csm6/Csx1和与Csm/Cmr复合物结合的其他CARF家族蛋白可能是由cOA调节的。
总之，这项研究揭示出原核生物免疫防御系统中的一种基于cOA的信号通路。这些研究人员证实当结合到靶RNA上时StCsm6合成出的cOA作为第二信使，结合到Csm6的CARF结构域上，激活Csm6的RNA酶活性，从而激活非特异性的RNA降解。当Csm复合物对有转录活性的DNA和它的转录本的协同降解不能够抵抗病毒时，这种信号通路可能作为应急措施发挥作用。不过不能确定的是cOA是否也能够作为进行细胞间通信的胞外信使发挥作用